冷冻切片（Frozen Section）基本原理、实验操作及注意事项

一、基本原理

冰冻切片（Frozen Section）是快速组织切片，通过在低温（-15至-23℃）恒温器的中将冰冻组织切割成需要的厚度（5-20μm）。组织样本的快速冷冻将水转化为冰，组织内的坚硬冰充当切割组织的包埋介质，冰冻组织切片一般用于免疫荧光（immunofluorescence, IF）实验。冰冻切片主要用于术中处理病灶的快速诊断，了解病灶范围，进行酶免疫细胞化学和免疫荧光研究，以及对组织中的脂质和某些碳水化合物进行染色，当然也适用于普通的基础生物学研究。

二、组织处理基本操作

1.新鲜组织固定

（1）洗涤：使用PBS将组织洗涤干净后；

（2）固定：在4℃使用4% 甲醛在摇床上固定组织2-4H（根据组织大小，避免固定组织超过 24 小时，因为组织抗原可能会被掩盖或破坏）；

（3）蔗糖沉降：使用30%蔗糖在4℃沉降组织2H（目的减少组织内水分，避免冰晶破坏细胞）；

（备注：实践过程中可以直接忽略（2）和（3），其中（2）可以在冰冻切片完成后再进行，此外，有的实验还不能用甲醛固定，因此需要提前做好准备）

2. 组织包埋与保存

（1）OCT包埋组织：将组织盛于做好标记的包埋盒中，加入预冷的OCT将整个组织覆盖；

（2）速冻组织：将盛有组织的包埋盒底部与液氮接触，可快速（10-20s）冷冻组织（速冻目的是防止细胞内形成冰晶）；

（3）组织冻存：一般情况下，将冻存保存-80℃冰箱中备用；

三、冷冻切片

（1）品托准备：将OCT添加至品托表面（2-3mm），然后放置于4℃冷处理10min备用；

（2）组织固定于品托：将保存于-80℃的包埋组织水平放置于品脱上，并置于低温恒温切片机载物台；

（3）组织复温：将（2）装载好的组织放置于低温恒温切片机载物台/速冻架上复温30min（如果标本太冷，切片会卷曲。如果太热，它会粘在刀上）；

（4）品托组装：将平托组长至组织固定台（rotary microtome）；

（5）刀片安装：将刀片按照5-7°进行安装，并固定好；

（6）修片：开始切割的时候，可以进行较厚的厚度进行切割，切割刀组织后换成低厚度切片；

（7）切片：现目前冷冻切片机的载片平台包含两种，一种是类似于石蜡切片的载片平台，需要将切片用毛笔将切片接住然后转移至载玻片；另外一种是切片直接进入载片平台，同样需要用毛笔将切片转移至载玻片；

（8）切片室温复温：将盛有组织切片的载玻片在30-37℃放置30min复温后进行后续实验。

四、注意事项

提高实验成功率的关键在于明白冰冻切片的基本原理以及注意事项，对于实践操作是一个熟能生巧的事儿，需要时间和精力去磨练。提高组织切片成功率需要注意如下事项：

（1）使用各种试剂耗材前认真阅读说明书，尤其是其中的注意事项；

（2）组织固定：室温下浸入10% 溶液中 4 至 8 h完成固定。普遍认为，固定剂的体积应比浸没组织的大小大50倍。避免固定组织超过 24h，因为组织抗原可能会被掩盖或破坏；

（3）一般来说灌注固定是比较常见的固定方式，除了肺、脾和胚胎组织，它们都是浸入固定的；

（4）低温恒温器温度在 -15 至 -23 °C 之间，如果标本太冷，切片会卷曲。如果太热，它会粘在刀上；

（5）将切片转移至含有明胶包被的组织学载玻片上，载玻片预先涂有明胶以增强组织的粘附性；

（6）将玻片在 30-37 °C 需要进行必要的复温操作，一般执行30min；

（7）速冻很关键，液氮，干冰速冻可以降低细胞内形成破坏性冰晶的可能性；